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    HPV

    Il Pap test rappresenta la tecnica che più di ogni altra, durante il 20° secolo, si è rivelata efficace negli screening per la prevenzione oncologica.
    Oggi possiamo affermare con forza che, globalmente, "il cancro della cervice uterina è una malattia delle donne che non sono adeguatamente screenate" ed anche che "non eseguire almeno un Pap test nel corso della vita riproduttiva" rappresenta un rilevante fattore di rischio per il cancro cervicale.

    Per controllare il tumore della cervice uterina sono quindi opportuni tutti gli sforzi per facilitare l'accesso di ogni donna al test di screening.


    Questo lavoro vuole contribuire al dibattito in corso: per studiarne gli sviluppi il "problema Pap test" viene scomposto in alcuni punti schematici.

    Metodo di campionamento ed allestimento dei vetrini.

    Il vecchio prelievo con "cotton fioc" si è rivelato assai poco efficace quando è stato paragonato al campionamento con spazzolino cervicale, ancora meglio se associato alla spatola di Ayre. Lo stesso vetrino viene per metà percorso col Cytobrush e per l'altra metà spalmato con la spatola: il numero dei preparati inadeguati per scarso campionamento viene così portato sotto lo 0,5%, contro il 3-8% del cotton fioc. Anche spazzolini esocervicali con un prolungamento per centrare il canale si sono dimostrati efficaci nel raccogliere cellule utero-vaginali.Sono però le più recenti metodiche in fase liquida o inmonostrato che stanno movimentando il settore: anziché strisciarlo sul vetrino, lospazzolino eso/endo cervicale viene lavato in una soluzione conservante così da portare

    le cellule in sospensione nel liquido. Al citologo arriva quindi un contenitore simile a
    quello per piccole biopsie ed il vetrino viene allestito in laboratorio con macchine
    automatiche che distribuiscono gli elementi raccolti al centro del preparato su un solo
    strato omogeneo, sottile, pulito da muco, detriti o altri contaminanti che potrebbero
    inquinare il campione. Sono disponibili due tipi di macchine per l'allestimento dei
    vetrini dalla "fase liquida" (Cytyc/ThinPrep e NeoPath/AutoCyte): in uno il
    liquido viene aspirato con una cannula provvista di un filtro a pori sottili per
    intrappolare le cellule; il filtro viene poi appoggiato sul vetrino, dove aderiscono le
    cellule selezionate. Nell'altro modello una parte del campione liquido viene mescolato con
    una soluzione densa; il tutto viene poi centrifugato per ottenere un gradiente grazie al
    quale le cellule si raggruppano in strati omogenei senza altri contaminanti. Aspirando con
    un piccolo tubo, lo strato con le cellule viene trasferito sul vetrino e steso in uno
    strato sottile, uniforme. Il Pap test in fase liquida comporta un radicale cambiamento
    delle abitudini del prelevatore, ma presenta numerosi vantaggi, soprattutto nella lettura
    al microscopio, oltre alla possibilità di allestire un secondo campione dal liquido
    rimasto, senza dover richiamare la donna.


    Le colorazioni con tecniche immunocitochimiche o con
    ibridizzazione in situ (es ViraPap) per evidenziare il papillomavirus umano (HPV) possono
    essere utili per identificare quelle donne affette da ceppi "ad alto rischio"
    (HPV 16 ed HPV 18), frequentemente associati a neoplasie cervicali; esistono tuttavia
    delle forti perplessità sul rapporto costi/benefici nella caratterizzazione dell'HPV,
    soprattutto in campioni di screening di popolazione.


    Le tecniche ispettive:
    colposcopia, speculoscopia, cervicografia ed endoscopia.


    La colposcopia, sviluppata nel 1925, è ben definita nella
    pratica ginecologica come quella metodica per individuare e delineare le lesioni rilevate
    con citologia e per mirare con precisione la biopsia ed ogni successiva pratica
    terapeutica (cono, LEEP...). Non è utile impiegare la colposcopia come primo esame di
    screening


    La speculoscopia è una metodica che sfrutta la luce di una
    capsula chemiluminescente fissata ad una valva del colposcopio: dopo trattamento con acido
    acetico, sulla mucosa esocervicale si riescono così ad evidenziare lesioni di difficile
    individuazione ad occhio nudo o anche con colposcopio. Il metodo ha un'alta sensibilità
    ma bassa specificità: è stata proposto in associazione al Pap test per individuare i
    casi che col solo esame citologico potrebbero sfuggire alla indicazione per colposcopia.
    In uno screening di popolazione i casi positivi con Pap test (da sottoporre ad
    accertamenti colposcopici) variano dal 4 al 9 % mentre con speculoscopia si porterebbero
    al 35 %, un livello di selezione decisamente troppo alto per uno screening, e che comunque
    non garantirebbe una assoluta protezione dai falsi negativi.


    La cervicografia (fotografia ad alta risoluzione della cervice,
    fatta con parametri rigidamente standardizzati) non presenta maggiore sensibilità della
    citologia in uno screening e la specificità sembra essere minore. Può trovare
    applicazioni in controlli di qualità della colposcopia ed in didattica.

    L'isteroscopia associata a prelievo di tessuto è il metodo più

    diretto per la diagnosi ed il trattamento delle lesioni intrauterine e la
    micro-istero-colposcopia può essere sfruttata per lo studio in vivo della patologia del
    canale cervicale.


    Terminologia e criteri di
    adeguatezza.


    La terminologia proposta dalla Conferenza di Consenso di
    Bethesda avrebbe dovuto portare ad una migliore uniformità sia nel numero delle classi e
    sottoclassi di Papanicolaou, che erano diventate francamente troppe, sia nei termini usati
    per qualificare un Pap test. Nonostante alcuni paesi, come Regno Unito e Giappone, siano
    ancora poco disponibili ad adottare il Sistema Bethesda, lo sforzo per unificare i criteri
    diagnostici è decisamente il più grande che i laboratori di citologia di tutto il mondo
    abbiano mai fatto.


    Il primo parametro da standardizzare è quello che qualifica un
    vetrino come "idoneo" per formulazione diagnostica: devono essere ben
    rappresentate le cellule squamose e soprattutto deve essere chiaramente dimostrabile il
    campionamento della zona di transizione con almeno tre gruppi distinti di cellule
    endocervicali. Il vantaggio più importante del sistema Bethesda è la netta separabilità
    delle lesioni positive (Lesione Squamosa Intra-epiteliale - SIL) dalle infiammazioni e
    dalle altre condizioni non neoplastiche. Permane ancora un'area grigia, costituita dalle
    "lesioni atipiche di incerto significato" (ASCUS ed AGUS) che rappresentano il
    punto più debole del Bethesda: se negli USA fungono da strumento di protezione (del
    citologo!) contro le denunce per malpractice, perché permettono di declinare una buona
    parte di responsabilità medico-legale, sono anche una esplicita dichiarazione di
    incertezza classificativa che, se estesa oltre il 5% delle diagnosi, porta ad un reale
    indebolimento dell'affidabilità diagnostica del Pap test. Nello screening di popolazione,
    dove la finalità è quella di individuare le donne asintomatiche da sottoporre a
    colposcopia, l'uso del termine ASCUS ha, francamente, poco senso.


    Il Sistema Bethesda ha comunque portato ad una migliore
    comprensione delle diagnosi citologiche, ma il numero complessivo delle donne con strisci
    anormali è significativamente cresciuto per effetto del nuovo nomenclatore e quindi è
    aumentata la domanda di colposcopie; è però dubbio che sia realmente migliorata
    l'efficacia della prevenzione oncologica rispetto all'epoca pre-Bethesda.


    Il PapillomaVirus Umano ed il vaccino
    anti-HPV


    Le evidenze dei dati epidemiologici, clinici e di biologia
    molecolare indicano inequivocabilmente che il carcinoma squamoso della cervice ed i suoi
    precursori sono causati dall'HPV, anche se è probabile che siano necessari dei cofattori
    per la trasformazione delle cellule epiteliali. La sorveglianza delle infezioni da HPV e
    la caratterizzazione di quei ceppi più frequentemente associati ad evoluzione
    displastica-neoplastica possono fornire interessanti segnali da monitorare nel follow up
    delle donne selezionate.


    Lo studio dell'infezione da HPV ha avuto due importanti effetti
    sulla diagnostica citologica cervico-vaginale: 1) i sistemi di classificazione citologica
    (sistema Bethesda - SIL) ed istologica (CIN) sono fortemente condizionati dalla presenza
    di segni di infezione virale, così come lo stanno diventando anche i protocolli di follow
    up clinico. 2) lo studio della biologia dell'infezione da HPV ha permesso di individuare
    modificazioni degli acidi nucleici e della produzione di proteine cellulari che possono
    essere sondate con biotecnologie per tentare di predire evoluzione dei precursori o
    lesioni in atto.


    E' dimostrato che lesioni da HPV sono reversibili in presenza di
    un efficiente sistema immunitario: si stanno conducendo studi sulla possibilità di
    produrre un vaccino per profilassi o immunoterapia contro uno dei componenti della
    struttura virale (1,2,19). Qualora questi studi portassero a risultati positivi muterebbe
    radicalmente l'epidemiologia dell'HPV ed anche del cancro della cervice uterina e
    dovrebbero evidentemente essere riconsiderati anche gli strumenti per la prevenzione ed il
    trattamento del cervico-carcinoma.


    Strumenti di lettura computerizzata
    dei vetrini


    La lettura automatica del Pap test sta lentamente acquistando
    elementi di affidabilità che solo qualche anno fa non poteva vantare (25): in questo
    settore si sono registrati investimenti rilevanti, con l'obiettivo di modificare
    tecnologicamente e culturalmente la lettura ottica tradizionale (14). L'uso del computer
    collegato al microscopio fa parte delle tematiche generali dell'analisi delle immagini
    digitali, ed in questo settore si sono cimentati non solo citologi ma anche ingegneri ed
    ottici fisici: le fasi di sviluppo dei progetti si possono così schematizzare.


    1) Sistemi per il controllo di qualità intesi come la rilettura dei preparati
    negativi per evitare false letture. Questa pratica, negli USA, è obbligatoria per legge
    su almeno il 10% dei test.

    La produttività media di un citotecnico americano è però di circa 80 strisci al
    giorno mentre in Italia è sensibilmente minore, con una qualità intrinseca migliore. I
    controlli di qualità nella nostra realtà hanno dimostrato una minore utilità che
    altrove, probabilmente perché la qualità di base è già più elevata (come anche i
    costi!). In situazioni dove si conduce uno screening di popolazione, il controllo di
    qualità può essere indirizzato anche a ridimensionare i falsi positivi, specie quelli
    che riguardano lesioni "di confine" (ASCUS e Sil di basso grado) ed il
    conseguente sovratrattamento: da risultati preliminari del nostro laboratorio lo studio
    con PapNet permette di riclassificare "non positiva" una rilevante percentuale
    di casi di ASCUS.


    2) Sistemi per selezionare solo gli strisci da rileggere al microscopio ottico,
    ovvero per scartare i negativi. In questo settore si stanno registrando le performances
    più interessanti: lo strumento AutoPap Screener (prodotto da NeoPath) (24) assicura
    (anche economicamente) l'esclusione del 25% dei casi in uno screening primario. Anche
    altre macchine (PapNet di NSI) si stanno proponendo per lo screening in prima battuta,
    oltre che per il controllo di qualità in citologia.


    3) Diagnosi automatica, direttamente dal computer, che esamina i preparati e
    produce anche un rapporto dettagliato su carta. Nessun sistema è attualmente in grado di
    proporre la diagnosi automatica, anche se sono stati presentati dei prototipi.
    Interessanti risultati in prospettiva possono essere ottenuti associando la lettura
    computerizzata alla preparazione in fase liquida ed eventualmente ad altre tecniche come
    lo studio morfologico della cervice, la speculoscopia e l'analisi biomolecolare dell'HPV,
    sfruttando la possibilità di eseguire due o più indagini dal materiale conservato in
    fase liquida.


    Nel rapporto con il citopatologo tradizionale sono presenti due
    principali approcci: quello che vede il sistema computerizzato progettato per assistere e
    potenziare il lavoro del citologo, come il PapNet, che funziona fotografando i quadri
    cellulari e poi proponendoli alla visione su monitor. Si demanda così completamente
    all'uomo l'interpretazione diagnostica (ed i problemi medico-legali). Il secondo approccio
    è quello che invece tenta una pre-interpretazione o una diagnosi di negatività,
    sostituendo in questa fase il citologo (es. AutoPap Screening).Sono infine stati messo a
    punto strumenti che semplicemente mappano la distribuzione cellulare su un vetrino
    (PathFinder e Cytoscanner Leica) ed eventualmente spostano il preparato automaticamente,
    così da rendere più rapido il lavoro del citologo, che non deve muovere il tavolino
    traslatore del microscopio. Questi sistemi sono finalizzati ad aumentare la produttività,
    con modesto aumento dei costi rispetto alla lettura convenzionale (8). In generale, il
    costo attuale dei sistemi computerizzati per interpretazione delle immagini è molto
    superiore alla lettura tradizionale che, nello screening di base, risulta ancora
    economicamente vantaggiosa: i dati di accuratezza propongono una migliore diagnostica dei
    sistemi automatici, specie quando le lesioni displastiche sono osservabili in poche,
    piccole cellule ed il preparato è molto cellulato.


    E' però prevedibile, per i sistemi automatici, un vantaggio
    sulla distanza, dato che il loro prezzo tenderà progressivamente a calare con la
    diffusione, mentre la produttività umana nella pratica tradizionale non potrà
    modificarsi di molto … e gli stipendi dovrebbero tendere, normalmente, ad aumentare


    L'organizzazione di uno screening di
    popolazione e la valutazione dei risultati


    Le scelte strategiche che stanno alla base di uno screening di
    prevenzione oncologica sono:






    garantire il test a tutte le persone che sono state scelte come target
    dell'iniziativa (universalità),
    effettuare il minor numero possibile di esami che comunque sostengono una valida
    copertura preventiva (efficienza ed efficacia),
    garantire la massima qualità tecnica degli esami di screening (sensibilità e
    specificità).

    Fare con molta cura solo gli esami necessari, è quindi la
    raccomandazione ripetuta. Le scelte non sono sempre state queste e comunque non paiono
    condivise universalmente, anche se l'evidenza epidemiologica è inequivocabile. Il
    problema dell'intervallo fra i test e del range di età da screenare viene talora ancora
    sollevato, ma non ci sono evidenze che Pap test annuali forniscano una protezione
    significativamente migliore di esami triennali.


    I cosiddetti cancri di intervallo, che insorgono durante un
    periodo di presunta copertura preventiva grazie all'esecuzione di un test, sono
    invariabilmente legati ad un errore in una delle fasi della procedura, specie prelievo e
    lettura. Una attenta cura nell'esecuzione garantisce quindi da questi inconvenienti.


    Per quanto concerne l'età, appare ormai accettato che il range
    dai 25 ai 65 anni rappresenti il miglior compromesso per garantire una buona copertura
    (18). Per più di 8 anni nello screening di Imola si sono convocate le donne a partire
    dalle diciottenni (3,5): nell'arco d'età 18-25 anni le lesioni displastiche osservate in
    citologia sono state pochissime ed ancor meno frequentemente sono state confermate
    all'istologia; nessuna conizzazione è stata necessaria.


    Per quanto riguarda il limite di età superiore, si sta
    accendendo un vivace dibattito sull'opportunità di interrompere lo screening negativo a
    50 anni (anziché a 65) dopo averlo eseguito diligentemente per 25 anni e sempre con test
    non patologici (15): a 50 anni è imperativo intraprendere lo screening di prevenzione per
    il cancro della mammella, enormemente più pericoloso, a quell'età, di quello della
    cervice uterina.


    Un punto debole di molti screening preventivi è la valutazione
    dei risultati, che in molti casi è troppo superficiale: si contano le donne che
    effettuano i Pap test, qualche volta gli indici di copertura della popolazione, i casi
    positivi individuati e gli interventi effettuati.


    Vale la pena di ricordare che la finalità dello screening non
    è quella di trovare più tumori, ma di ridurre la mortalità per la patologia oggetto
    dello screening. Occorre perciò almeno conoscere i dati di mortalità prima e durante
    l'iniziativa; ancor meglio se con un registro tumori si sorveglia anche l'incidenza
    nell'area coinvolta; altri utili indicatori di epidemiologia vanno raccolti e valutati
    (16) per monitorare e migliorare l'organizzazione dello screening.


    Problematiche medico-legali


    Le lagnanze per non aver visto cellule atipiche in Pap test
    (esami falsi negativi) costituiscono il maggior problema di malpractice o litigation per
    citologi americani: la possibilità di individuare comunque lesioni borderline che
    incorporano il concetto di "caso dubbio" (ASCUS) costituisce un'efficace linea
    difensiva (...qualcosa di anomalo era comunque stato individuato...) ma diminuisce di
    molto l'efficacia diagnostica e preventiva del Pap test. In Italia il problema è molto
    meno sentito ma è stato ugualmente importato l'infausto concetto di ASCUS.


    In una realtà con uno screening avanzato, esiste anche un altro
    problema frequente, quello del sovratrattamento delle SIL di basso grado citologiche,
    degli ASCUS e delle displasie lievi - CIN 1 istologiche: nonostante una elevata
    probabilità di regressione spontanea, in questi casi non è infrequente osservare
    conizzazioni "precauzionali" o LEEP diagnostiche che rappresentano un
    sovraccarico di spesa improprio per il servizio sanitario, oltre che di ansia per la
    donna.


    Controllo e garanzia di qualità


    Il controllo e la garanzia di qualità fanno parte di strategie
    complesse che si intrecciano con le tematiche di accreditamento e certificazione, molto di
    moda nel sistema sanitario italiano quanto sconosciute e poco applicate nella sostanza dei
    fatti.


    La strategia dello screening che prevede pochi Pap test ma ben
    fatti darà risultati in termini di efficacia preventiva se la qualità complessiva del
    sistema è alta. Il problema dei falsi negativi è solo un aspetto della questione, ma è
    quello più stressato per le ragioni medico-legali sopra riportate.


    La qualità della prestazione citologica rappresenta il cuore
    della prevenzione cervicale: qui le macchine, le nuove metodiche, i confronti intra ed
    interlaboratorio su diagnosi specifiche sono utili ma in uno screening organizzato vanno
    tenuti presente anche altri parametri importanti (7) come:







    l'organizzazione del programma di screening;
    i percorsi previsti per le chiamate, i controlli, gli interventi ed i follow up;
    la verifica dei risultati;
    la formazione continua del personale.





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